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實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術服務

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詳細介紹Detailed Introduction

熒光定量PCR檢測

  實時熒光定量PCR原理
  實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術是利用熒光染料或熒光標記的特異性探針,通過實時監控PCR反應中產物變化量的熒光信號,從而實現對起始模板定量及定性的分析。
  實驗用途
  1、普通基因表達水平的檢測:
  能夠快速準確的定量出相關基因在不同組織或生命狀態下的相對表達水平。
  2、基因拷貝數的檢測:
  能夠準確的定量出相關基因在染色體中的拷貝數,特別適用于檢測轉基因植物中外源T-DNA在植物基因組中的拷貝數。
  3.特殊RNA的轉錄水平檢測:
  根據特殊RNA的結構,如microRNA,CircRNA等,;設計其特殊引物,如頸環結構引物,反向引物等,對這類RNA的轉錄水平進行定量,定性分析。
  服務內容
  1.從不同樣品中提取核酸(DNA或RNA);
  2.對核酸進行濃度及純度評級;
  3.熒光定量PCR檢測;
     (1)引物和探針的設計與合成;
  (2)絕對定量和相對定量的選擇;
  (3)探針法和染料法的選擇;
  (4)熒光定量PCR儀對目的基因的檢測;
  (5)數據統計和分析(RNA濃度及質量檢測報告、熒光定量PCR原始數據及優化數據、擴增曲線,溶解曲線,表達柱形圖等);
  4.預實驗服務:根據客戶提供的目的基因序列或NCBI序列號提供客戶引物和探針,并篩選出最優化的引物和探針;
  5.正式實驗服務:根據預實驗篩選的引物和探針對所用樣品進行熒光定量PCR的檢測,并對結果進行統計和分析。
  實驗流程和周期
  客戶在線下單—確認訂單/實驗材料信息—提取RNA及反轉錄cDNA—引物設計—加樣及上機—處理分析實驗數據—整理實驗報告。
  優勢特點
  1、高效穩定的檢測出低豐度mRNA。
  2、數據處理優化,提高數據準確性。
  客戶下單
  下單流程:注冊成為用戶,登錄客戶端進行下單。
  項目息填信寫:
  1、客戶按照頁面提示填寫項目名稱,選擇項目類型,填寫個人信息及聯系方式進行預提交;
  2、提交項目所需要的具體信息,包括:目標基因準確序列,基因名稱、同源基因等注釋信息,如果特別要求請在備注中注明。填寫完畢后價格由系統自動計算生成。
  3.同一類型的樣品至少要到達16個以上,則不收取常規引物合成費用,否則按照1元/bp收取常規引物合成費用。
  客戶提供信息
  1.請提供新鮮材料或直接提供已純化的DNA/RNA,確保總量>5μg/樣品。如果目的基因表達量較低時,應盡量提供更高濃度的總RNA或DNA;
  2.液氮或干冰保存寄送的樣品;凍存于Trizol中的樣品。
  3.請提供已知的全長目標基因和參考基因序列(GeneBank Accession Number、Gene ID);
  4.請提供盡可能詳細的背景資料:生物物種信息、DNA/RNA來源、豐度等,同源性等;
  5.客戶可以提供引物,沒有引物的情況下,本公司幫助設計合成。
  備注:microRNA,CircRNA等特殊RNA,提取加逆轉錄500元/樣
  實驗信息
  實驗過程中客戶可以隨時登錄管理系統查看項目實時進展情況。實驗結題時系統會通過短信自動通知客戶,并發送實驗報告查看地址。實驗結題后,實驗報告,檢測結果可在線查看或打印,并永久保留。
  實驗結果
  1、RNA濃度及質量檢測報告;
  2、熒光定量PCR原始數據及優化數據;
  3、擴增曲線,溶解曲線;
  4、基因表達水平的柱形圖。
  RNA評級辦法
  (1)電泳法
  可以用于反轉錄的RNA質量標準為,28S和18S兩條帶完整,有無5S條帶均可(5S條帶存在的時候,就說明你提取的RNA質量非常棒),28S亮度大約是18S條帶的兩倍左右,無DNA污染。
  (2)微量分光光度計
  RNA質檢參數OD260/OD280、OD260/OD230的意義。
  260、280、320、230nm下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質、鹽濃度和有機溶劑的值。
  230: 測定其它碳源物質,如酚,糖類等。
  A260:核酸的吸收峰測,測RNA,DNA,引物等的濃度用的。
  A280:蛋白質的吸收峰。
  一般的,我們只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范圍內時,我們認為 RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不過要注意,當用 Tris 作為緩沖液檢測吸光度時,R 值可能會大于 2(一般應該是<2.2的)。當R < 1.8時,溶液中蛋白的污染比較明顯,可以根據自己的需要決定這份RNA 的命運。當R > 2.2時,說明RNA已經水解成單核酸了。純RNA的OD260/OD280的比值為2.0。
  RNA質量檢驗
  RNA樣品的品質檢測一般分為總量,純度與完整性三大項。
  總量:微量分光光度計測260nm吸收值計算。
  純度:微量分光光度計測260nm/230nm吸收值的比值,用于評估有機溶劑殘留;260nm/280nm吸收值的比值,用于評估蛋白質污染比例。

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